Vistas embriju infekcija. Vistu embriju eksperimentālās inficēšanas metodes Skatiet, kas ir “vistas embrijs” citās vārdnīcās
Sagatavoja: skolotāja Ugiševa Sh.E.
3. slaids
Vīrusu struktūra
4. slaids
Vīrusu struktūra A – vienkāršs vīruss B – kompleksais vīruss
5. slaids
Pamatojoties uz bīstamības pakāpi, vīrusus iedala četrās grupās: I grupa: Ebolas, Lasas, Marburgas, Mačupo drudža, baku un B hepatīta vīrusa izraisītāji (pērtiķi). II grupa: arbovīrusi, daži arenavīrusi, trakumsērgas vīrusi, cilvēka C un B hepatīta vīrusi, HIV. III grupa - gripas vīrusi, poliomielīts, encefalomiokardīts, vakcinācija. IV grupa - adenovīrusi, koronavīrusi, herpesvīrusi, reovīrusi, onkovīrusi.
6. slaids
7. slaids
Vīrusu klasifikācijas principi Nukleīnskābes veids, struktūra, replikācijas stratēģija Izmērs, morfoloģija, viriona simetrija, kapsomēru skaits, superkapsīda klātbūtne. Specifisku enzīmu klātbūtne, īpaši RNS un DNS POLIMERĀZES, neiraminidāzes Jutība pret fizikāliem un ķīmiskiem aģentiem, īpaši ēteri Imunoloģiskās īpašības Dabiski transmisijas mehānismi Tropisms uz saimniekorganismu, tā audiem un šūnām Patoloģija, ieslēgumu veidošanās Slimību simptomatoloģija.
8. slaids
Vīrusu klasifikācija (satur RNS)
9. slaids
Vīrusu klasifikācija (satur DNS)
10. slaids
Vīrusu ķīmiskais sastāvs Pie vīrusiem pieder nukleīnskābes, olbaltumvielas, lipīdi, glikolipīdi un glikoproteīni. Tie vienmēr satur viena veida nukleīnskābes (DNS vai RNS), kas veido no 1% līdz 40% no viriona masas. Vīrusu genomi satur informāciju, kas ir pietiekama tikai dažu olbaltumvielu sintēzei. To masa sasniedz 10-15 mg, kas ir 1 miljonu reižu mazāka nekā šūnām, un garums ir līdz 0,093 mm Nukleotīdu pāru skaits svārstās no 3150 (B hepatīta vīruss) līdz 230 000 (variola vīruss). Vīrusu olbaltumvielas (70-90%) iedala strukturālajos un nestrukturālajos. Strukturālie - proteīni, kas ir daļa no nobriedušiem ārpusšūnu virioniem. Tie veic vairākas svarīgas funkcijas: - aizsargā nukleīnskābi no ārējiem bojājumiem; mijiedarbojas ar jutīgu šūnu membrānām; nodrošina vīrusa iekļūšanu šūnā; - ir RNS un DNS polimerāzes aktivitāte utt. Nestrukturālie proteīni ir nav daļa no nobriedušiem virioniem, bet veidojas to vairošanās laikā. Tie: - nodrošina vīrusa genoma ekspresijas regulēšanu - ir vīrusu proteīnu prekursori, kas var nomākt šūnu biosintēzi. Atkarībā no to atrašanās vietas virionā proteīnus iedala kapsīdos, superkapsīdos, matricās, kodolproteīnos un ar nukleīnskābēm saistītajos proteīnos. Lipīdi (15-35%) ir ietverti kompleksos vīrusos un ir daļa no superkapsīda apvalka, veidojot tā dubulto lipīdu slāni. Tie: - stabilizē vīrusa apvalku - nodrošina virionu iekšējo slāņu aizsardzību no ārējās vides hidrofilām vielām - piedalās virionu deproteinizācijā.
11. slaids
Vīrusu pavairošana. Tās īpatnības ir tādas, ka genomus pārstāv gan RNS, gan DNS, tie ir daudzveidīgi pēc struktūras un formas, gandrīz visas vīrusu RNS spēj vairoties neatkarīgi no šūnas DNS.Vīrusiem ir raksturīga disjunktīva vairošanās metode, kas sastāv no fakts, ka genoma un vīrusa proteīnu sintēze ir atdalīta telpā un laikā: nukleīnskābes replikējas šūnas kodolā, olbaltumvielas citoplazmā un veselu virionu savākšana var notikt uz citoplazmas membrānas iekšējās virsmas. Vīrusu reprodukcija ir unikāla sistēma svešas informācijas atjaunošanai eikariotu šūnās un nodrošina šūnu struktūru absolūtu pakļaušanu vīrusu vajadzībām. Vīrusu reprodukcijā ir vairāki posmi. Agrīnie ietver vīrusu adsorbciju uz šūnas virsmas, to iekļūšanu (iekļūšanu) šūnā un izģērbšanos (deproteinizāciju). Vēlīnās stadijas (vīrusa genoma stratēģija) ietver vīrusu nukleīnskābju sintēzi, proteīnu sintēzi, virionu montāžu un vīrusa daļiņu izdalīšanos no šūnas.
12. slaids
Vīrusu pieķeršanos šūnas virsmai nodrošina divi mehānismi: nespecifisks un specifisks. Nespecifisko nosaka elektrostatiskās mijiedarbības spēki, kas rodas starp ķīmiskajām grupām uz vīrusu virsmas un šūnām, kurām ir dažādi lādiņi. Specifisko mehānismu (reverso un neatgriezenisko adsorbciju) nosaka komplementāri vīrusu un šūnu receptori. Tie var būt proteīni, ogļhidrāti vai lipīdi. Piemēram, gripas vīrusu receptors ir sialskābe. Receptoru skaits adsorbcijas vietās var sasniegt 3000. Uz vīrusu virsmas receptori parasti atrodas padziļinājumu un plaisu apakšā. Vīrusu iekļūšana šūnā notiek, izmantojot receptoru endocitozes mehānismu (viropeksijas variants) īpašās šūnu membrānu zonās, kas satur īpašu bloku ar augstu molekulmasu - klatrīnu. Membrānas invaginējas un veidojas ar klatrīnu pārklāti intracelulāri vakuoli. to skaits var sasniegt 2000. Vakuoli apvienojas, veidojot receptosomas, un pēdējās saplūst ar lizosomām. Vīrusu virsmas proteīni mijiedarbojas ar lizosomu membrānām, un to nukleoproteīns izdalās citoplazmā. Tomēr ir vēl viens mehānisms vīrusu iekļūšanai šūnā - membrānas saplūšanas indukcija. Tas notiek, pateicoties īpašam vīrusa saplūšanas proteīnam (F- no saplūšanas - saplūšana). Šī procesa rezultātā vīrusa lipoproteīnu apvalks integrējas ar šūnas membrānu, un tā genoms iekļūst šūnā. Šāds proteīns ir identificēts gripas vīrusos, paragripas vīrusos, rabdovīrusos u.c.
13. slaids
Virionu izģērbšanās ir daudzpakāpju process, kura laikā tiek atbrīvots to nukleīna aparāts, pazūd aizsargčaulas, kas kavē genoma ekspresiju. Tas notiek specializētās jomās - lizosomās un Golgi aparātā. Vēlākie reprodukcijas posmi ir vērsti uz vīrusu nukleīnskābju un olbaltumvielu sintēzi. Replikācijas mehānisms (vīrusu genomu veidošanās, kas ir precīza priekšgājēja kopija) ir atkarīgs no nukleīnskābes īpašībām. Tas nav vienāds dažādu veidu vīrusiem. Replikācija vīrusos, kas satur RNS, notiek pēc līdzīgiem modeļiem. mRNS tiek sintezēta uz mātes RNS, un RNS starpposma formas kalpo par vīrusa genoma sintēzes veidni. Transkripcija ir kurjer-RNS veidošanās process. Tas notiek ar īpašu enzīmu palīdzību, ko sauc par DNS vai RNS atkarīgām RNS polimerāzēm. DNS vīrusiem ir šie šūnu izcelsmes enzīmi, savukārt RNS vīrusiem ir savas vīrusam specifiskās transkriptāzes. Tulkošanas stadijā ģenētiskā informācija tiek nolasīta no ziņotāja RNS un pārvērsta aminoskābju secībā. Process notiek ribosomās. RNS molekulas pārvietojas ribosomās saskaņā ar tripleta koda secību, ko atpazīst pārneses RNS. Pēdējie pārnēsā aminoskābes īpašās vietās.
14. slaids
15. slaids
16. slaids
Vīrusu audzēšana Vistas embriji 6-12 dienu vecumā. Infekcijas metodes - atvērta, slēgta
17. slaids
Vīrusu kultivēšana Šūnu kultūras: - primāri tripsinizētas cilvēka embriju kultūras, pērtiķu nieres, vistas embriju fibroblasti utt.; spēj augt vairākās ejās kā sekundāras kultūras; transplantējamās šūnas; tās ir šūnu kultūras, kas ieguvušas neierobežotas augšanas un vairošanās spēju; Tos iegūst no audzējiem vai no normāliem cilvēka vai dzīvnieku audiem, kuriem ir izmainīts kariotips. HeLa (dzemdes kakla karcinoma) Hep-2 (cilvēka balsenes karcinoma), CV (cilvēka mutes karcinoma), RD (cilvēka rabdomiosarkoma), RH (cilvēka embrija nieres), Vero (zaļās pērtiķa nieres), SPEV (cūkas embrija nieres), VNK- 32 (Sīrijas kāmja nieres). Šūnu kultūras diploīdās šūnas; Tās ir viena veida šūnu kultūras, tām ir diploīds hromosomu komplekts un tās spēj izturēt līdz 100 subkultūrām laboratorijas apstākļos. Tie ir ērts paraugs vīrusu vakcīnu preparātu iegūšanai, jo tie nav inficēti ar svešiem vīrusiem, saglabā sākotnējo kariotipu pasāžas laikā un tiem nav onkogēnas aktivitātes. Visbiežāk viņi izmanto kultūras līnijas, kas iegūtas no cilvēka embrija fibroblastiem (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), govīm, cūkām, aitām un tamlīdzīgiem. Šūnu kultūras uzglabā sasaldētas.
18. slaids
Barības barotnes, ko izmanto, lai atbalstītu šūnu kultūras vai to augšanu, var būt dabiskas vai sintētiskas (mākslīgas). Dabiskā barotne - liellopu asins serums, šķidrumi no seroziem dobumiem, piena hidrolīzes produkti, dažādi hidrolizāti (5% hemohidrolizāts, 0,5% laktoalbumīna hidrolizāts) vai audu ekstrakti. To ķīmiskais sastāvs palīdz radīt apstākļus, kas ir līdzīgi tiem, kādi pastāv cilvēka ķermenī. Būtisks šādu mediju trūkums ir to nestandarta raksturs, jo tos veidojošo komponentu kvalitatīvais un kvantitatīvais sastāvs var atšķirties. Sintētiskajām barotnēm šī trūkuma nav, jo to ķīmiskais sastāvs ir standarta, jo tās iegūst, mākslīgos apstākļos kombinējot dažādus sāļu šķīdumus (vitamīnus, aminoskābes). Šie visbiežāk izmantotie šķīdumi ietver barotni 199 (primāro tripsinizētu un nepārtrauktu šūnu kultūru kultivēšana), Eagle barotni (satur minimālu aminoskābju un vitamīnu komplektu un izmanto diploīdu šūnu līniju un nepārtrauktu šūnu kultivēšanai), EagleMEM barotni (kultivācija). īpaši prasīgām šūnu līnijām), šķīdums Hanks, ko izmanto barotņu izgatavošanai, šūnu mazgāšanai utt.
19. slaids
20. slaids
21. slaids
Laboratorijas dzīvnieku infekcija. Virusoloģijā plaši tiek izmantoti daudzi laboratorijas dzīvnieki vīrusu izolēšanai un identificēšanai, specifisku pretvīrusu serumu iegūšanai, vīrusu slimību patoģenēzes dažādu aspektu izpētei, slimību apkarošanas un to profilakses metožu izstrādei. Visbiežāk tiek izmantotas dažāda vecuma baltās peles (divas dienas vecas), baltās žurkas, jūrascūciņas, truši, gophers, vates žurkas, pērtiķi un citi.
22. slaids
Ir dažādi veidi, kā inficēt dzīvniekus, atkarībā no vīrusu tropisma un slimības klīniskās ainas. Testējamo materiālu var ievadīt: - caur muti - elpošanas traktā (ieelpojot, caur degunu) - ādā - intradermāli - subkutāni, intramuskulāri - intravenozi - intraperitoneāli - intrakardiāli - uz skarificētās radzenes - acs priekšējā kamerā. - smadzenēs.
23. slaids
24. slaids
25. slaids
26. slaids
Bakteriofāgi (fāgi) (no sengrieķu φᾰγω — “es ēdu”) ir vīrusi, kas selektīvi inficē baktēriju šūnas. Visbiežāk bakteriofāgi vairojas baktēriju iekšienē un izraisa to līzi. Parasti bakteriofāgs sastāv no proteīna apvalka un vienas vai divpavedienu nukleīnskābes (DNS vai retāk RNS) ģenētiskā materiāla. Daļiņu izmērs ir aptuveni 20 līdz 200 nm. Neatkarīgi no Frederika Tverta, franču un kanādiešu mikrobiologa D'Herelle, Fēlikss ziņoja par bakteriofāgu atklāšanu 1917. gada 3. septembrī. Līdz ar to ir zināms, ka krievu mikrobiologs Nikolajs Fedorovičs Gamaleja tālajā 1898. gadā pirmo reizi novēroja baktēriju (sibīrijas mēra bacillus) līzes fenomenu transplantējama līdzekļa ietekmē. Dzīves cikls Mēreniem un virulentiem bakteriofāgiem mijiedarbības sākumposmā ar baktēriju šūnu ir vienāds cikls. Bakteriofāga adsorbcija uz fāgam specifiskiem šūnu receptoriem. Fāga nukleīnskābes ievadīšana saimniekšūnā. Fāga un baktēriju nukleīnskābes kopreplikācija. Šūnu dalīšanās. Turklāt bakteriofāgs var attīstīties pēc diviem modeļiem: lizogēnā vai lītiskā ceļa. Mēreni bakteriofāgi pēc šūnu dalīšanās atrodas profāga stāvoklī (lizogēnais ceļš). Virulentie bakteriofāgi attīstās pēc Lytic modeļa: fāga nukleīnskābe vada fāgu enzīmu sintēzi, šim nolūkam izmantojot baktēriju proteīnu sintezēšanas aparātu. Fāgs vienā vai otrā veidā inaktivē saimnieka DNS un RNS, un fāga enzīmi to pilnībā noārda; Fāga RNS “pakārto” šūnu aparātu proteīnu sintēzei. Fāga nukleīnskābe atkārto un vada jaunu apvalka proteīnu sintēzi. Jaunas fāga daļiņas veidojas proteīna apvalka (kapsīdu) spontānas pašsavienošanās rezultātā ap fāga nukleīnskābi; Lizocīms tiek sintezēts fāga RNS kontrolē. Šūnu līze: šūna pārsprāgst lizocīma ietekmē; tiek atbrīvoti aptuveni 200-1000 jaunu fāgu; fāgi inficē citas baktērijas. 1 - galva, 2 - aste, 3 - nukleīnskābe, 4 - kapsīds, 5 - "apkakle", 6 - astes proteīna apvalks, 7 - astes fibrila, 8 - muguriņas, 9 - pamatplāksne
27. slaids
Vistas embrija infekcija Vistas embriju izmanto vīrusu un mikoplazmu kultivēšanai. Embrijus izmanto 8-14 dienu vecumā atkarībā no vīrusa veida un inficēšanās metodes; uz horionalantoisu membrānu, uz alantoju un amnija dobumu, uz dzeltenuma maisiņu. Pirms inficēšanās ovoskopā nosaka embrija dzīvotspēju un ar zīmuli uz čaumalas iezīmē gaisa maisiņa robežas. Vistas embriju inficēšana tiek veikta kastē stingri aseptiskos apstākļos, izmantojot instrumentu, kas sterilizēts vārot. Korpusu virs gaisa telpas noslauka ar spirtu, sadedzina liesmā, iesmērē ar 2% joda šķīdumu, vēlreiz noslauka ar spirtu un sadedzina. Vīrusu materiāls 0,05–0,2 ml daudzumā tiek uzklāts uz horiona-alantoīda membrānas ar tuberkulīna šļirci vai Pastēra pipeti. Embriji tiek atdalīti pēc 48–72 stundu inkubācijas termostatā. Vīrusa atrašanos hrolantojā membrānā nosaka: 1. Ar dažādu formu bālganiem necaurspīdīgiem plankumiem; 2. Hemaglutinācijas reakcijā.
28. slaids
29. slaids
30. slaids
31. slaids
Paldies!!!
Skatīt visus slaidus
Viroloģiskajiem pētījumiem izmanto 7-12 dienas vecus vistu embrijus ( visbiežāk 9-12 dienas, dažreiz 5-12 dienas).
Pirms inficēšanās tiek noteikta embrija dzīvotspēja. Ovoskopijas laikā dzīvie embriji ir mobili, un asinsvadu modelis ir skaidri redzams. Gaisa maisa robežas ir atzīmētas ar vienkāršu zīmuli. Vistas embrijus inficē aseptiskos apstākļos, izmantojot sterilus instrumentus, pēc čaumalas virs gaisa telpas iepriekšējas apstrādes ar jodu vai spirtu.
Vistas embriju inficēšanas metodes var būt dažādi: vīrusa uzklāšana horioalantoīdā membrānā, amnija un alantojas dobumos, dzeltenuma maisiņā un embrija ķermenī. Infekcijas metodes izvēle ir atkarīga no pētāmā vīrusa bioloģiskajām īpašībām.
Ir divi veidi, kā inficēt vistas embrijus:
1) atvērts - apvalku virs gaisa maisa apstrādā ar spirtu un jodu, ar asām šķērēm nogriež apvalku, noņem gaisa maisa apvalka augšējo loksni un veic infekciju. Caurumu aizver ar speciālu stikla vāku vai apvalku un aizzīmogo ar sterilu kausētu parafīnu.
2) Slēgts - apvalku virs gaisa maisa apstrādā ar spirtu un jodu, čaulā ar pīrsinga instrumentu izveido caurumu un ar šļirci ar resnu adatu zem kontroles ievada 0,1-0,2 ml vīrusu saturoša materiāla. no ovoskopa. Caurums ir aizvērts ar sterilu kausētu parafīnu.
Inficētos embrijus inkubē termostatā 2-4 dienas. Pēc tam tos visu dienu atdzesē līdz 4ºC, lai nodrošinātu maksimālu vazokonstrikciju. Atveriet sterilos apstākļos, iepriekš apstrādājot apvalku ar spirtu vai jodu.
Vīrusa klātbūtni vistas embrijā norāda embrija nāve, pozitīva hemaglutinācijas reakcija uz stikla ar alantoju vai amnija šķidrumu un fokālie bojājumi (“plāksnes”) uz horiona-alantoīda membrānas.
Vīrusus var kultivēt tikai dzīvās šūnās. Šim nolūkam tiek izmantota jebkura bioloģiskā sistēma: dzīvnieku organismi, vistu embriji, šūnu kultūras. Izvēloties laboratorijas dzīvniekus, jāievēro šādas prasības: - dzīvniekiem jābūt veseliem. Jaunienācēji vivārijā tiek turēti karantīnā (peles un žurkas 14 dienas, citas 21 dienu). Lai izslēgtu latentās (slēptās) vīrusu etioloģijas infekcijas.
Visiem dzīvniekiem ir ievērotas šādas prasības: - dzīvniekiem jābūt jutīgiem pret šo vīrusu; - liela nozīme ir dzīvnieka vecumam: visjutīgākie ir jaundzimušie un jaundzimušie, bet atsevišķos gadījumos tiek izmantoti pieauguši dzīvnieki, lai noteiktu skaidras slimības klīniskās pazīmes; - dzīvniekiem jābūt vienāda vecuma un ķermeņa svara; Tam labāk piemēroti lineārie dzīvnieki, t.i. iegūts inbrīdinga rezultātā.
Viroloģiskajiem pētījumiem izmanto subkutānu, ādas, intradermālu, intramuskulāru, intraperitoneālu, intravenozu, perorālu, intranazālu un intracerebrālu laboratorijas dzīvnieku infekciju.
Tēmas "Baktēriju kultivēšana. Baktēriju kultivēšanas metodes. Koloniju pazīmes." satura rādītājs:Orgānu kultūras vīrusu noteikšanai. Vistas embriji vīrusu infekciju diagnostikā. Infekcija ar cāļu embrija vīrusu. Inficēšanās metodes ar vistas embrija vīrusu.
Ne visi šūnu veidi spēj augt monoslonu formā; dažos gadījumos diferencētu šūnu saglabāšana ir iespējama tikai orgānu kultūra. Parasti tā ir audu suspensija, kam ir īpaša funkcija, ko dēvē arī par izdzīvojušo audu kultūru.
Vistas embriji vīrusu infekciju diagnostikā
Vistas embriji(11.-20. att.) ir gandrīz ideāli modeļi noteiktu vīrusu (piemēram, gripas un masalu) kultivēšanai. Slēgtais embrija dobums novērš mikroorganismu iekļūšanu no ārpuses, kā arī spontānu vīrusu infekciju attīstību. Embrijus izmanto primārai vīrusu izolēšanai no patoloģiskā materiāla; to pārvietošanai un saglabāšanai, kā arī nepieciešamā vīrusa daudzuma iegūšanai. Daži patogēni (piemēram, herpes vīrusi) izraisa raksturīgas izmaiņas (slimību pēc tiem var atpazīt). Infekcija tiek veikta uz horiona-alantoīda membrānas, amnija vai alantojas dobumā vai dzeltenuma maisiņā.
Vīrusu infekcija uz horiona-alantoīda membrānas. Parasti tiek izmantoti 10-12 dienu veci embriji. Olas tiek aplūkotas caurlaidīgā gaismā, tiek atzīmēta gaisa maisiņa atrašanās vieta un tiek izvēlēta vieta bez asinsvadiem. Uzmanīgi noņemiet čaumalas fragmentu, atbrīvojiet ārējo apvalku un noņemiet to ar vieglu spiedienu. Pēc tam gaisa maisa malā tiek izveidots caurums. Izsūcot caur šo caurumu, no ārējās membrānas tiek nolobīta horionalantoiskā membrāna. Uz tā tiek uzklāts testa materiāls, kurā nav baktēriju un vienšūņu (izlaiž cauri baktēriju filtriem un apstrādā ar baktericīdiem). Infekcija amnija dobumā. Parasti tiek izmantoti 7-14 dienu veci embriji, kuros pēc horionalantoiskās membrānas atslāņošanās (skat. iepriekš) atvere tiek paplašināta, amnija membrāna tiek satverta ar pinceti un izņemta caur horionalantoisko membrānu. Caur to testa materiāls tiek ievadīts amnija dobumā.
Vīrusu infekcija alantoiskā dobumā. 10 dienu veci embriji tiek inficēti caur caurumiem, kas izveidoti čaumalā un pamatā esošajās membrānās (skatīt iepriekš).
Vīrusu infekcija dzeltenuma maisiņā. Tiek izmantoti 3-8 dienas veci embriji, kuros šajā vecumā dzeltenuma maisiņš aizņem gandrīz visu olas dobumu. Infekcija tiek veikta caur caurumu, kas izveidots gaisa maisiņā.
Rīsi. 11-20. Attīstoša cāļu embrija shematisks attēlojums.
Inficēšanās ar vistas embrija vīrusu rezultātu novērošana un reģistrēšana
Saturu var izmantot kā vīrusu saturošu materiālu dzeltenuma maisiņš, alantoju un amnija šķidrumu vai visu embriju, sagriež gabalos kopā ar apkārtējiem audiem. Lai identificētu raksturīgos bojājumus uz horionalantoiskās membrānas, tiek noņemts apvalks un ārējā membrāna. Pēc tam membrānu noņem un ievieto sterilā ūdenī. Bojājumu raksturs tiek pētīts uz tumša fona.
Vistas embrijs Vistas embrijs
(CE) - vistas embrijs, kas atrodas dažādās embrija attīstības stadijās. Mikrobiolā. praksē tos izmanto vīrusu, riketsiju un dažkārt baktēriju izolēšanai, kultivēšanai un identificēšanai. Laboratorijas vajadzībām izvēlas svaigas, apaugļotas EC ar labi caurspīdīgu un neplaisājošu apvalku. Inkubācija tiek veikta trijkāju ligzdās ar olas neaso galu uz augšu labi vēdināmos inkubatoros vai termostatos 37-37,5 ° C temperatūrā, relatīvais mitrums 63-65%. Infekcijai tiek atlasīti 4-13 dienu veci embriji ar izteiktiem asinsvadiem, dzeltenuma maisiņu un kustīgu ēnu. Pirms inficēšanās olu čaumalas apstrādā ar spirtu, sadedzina un ievadīšanas zonā (parasti virs gaisa kameras) iesmērē ar 2% joda tinktūru. Materiāls vai pētījums to injicē, atverot vai neatverot čaumalu, dzeltenuma maisiņā (riketsija), alantoiskā vai amnija dobumā (lielākā daļa vīrusu) un uzklāj uz horiona-alantoīda membrānas. Retāk to injicē embrija ķermenī vai intravenozi. Inficētās EC tiek ievietotas termostatā tādos apstākļos un uz laiku, kas ir atkarīgi no mikroba veida un pētījuma mērķiem. Atsevišķus datus par infekcijas rezultātiem var iegūt, veicot EK ārējo izmeklēšanu mikroskopā (asinsvadu injekcija, mobilitātes zudums utt.). Tomēr vairumā gadījumu EK tiek atvērta. Lai to izdarītu, pēc apstrādes ar spirta un joda tinktūru virs gaisa maisa robežas nogriež čaumalu, vispirms ar Pastēra pipeti vai šļirci izsūc alantoīdu un pēc tam amnija šķidrumu, izvairoties no asinsvadu un dzeltenuma maisiņš. Embriju un horioalantoīdu membrānu izņem no čaumalas, ievieto sterilos trauciņos un mazgā ar sterilu destilātu. ūdeni un pārbaudiet. Tālākā embrija un tā šķidrumu izpētes gaita ir atkarīga no mikroba vai vīrusa veida un eksperimenta mērķa.
(Avots: Mikrobioloģijas terminu vārdnīca)
Skatiet, kas ir “vistas embrijs” citās vārdnīcās:
EMBRIOTOKSISKUMS- embriotoksicitāte, fizikālo, bioloģisko, ķīmisko un citu faktoru spēja negatīvi ietekmēt embriju attīstību. Dažādu vielu embriotoksiskā iedarbība tiek noteikta, pakļaujot tās mātītēm... ... Veterinārā enciklopēdiskā vārdnīca
Pieprasījums pēc "Cāļiem" tiek novirzīts uz šejieni; skatīt arī citas nozīmes. ? Mājas vista ... Wikipedia
Vistas Vistas ir jebkura pagalma rotājums Zinātniskā klasifikācija Karaliste: Dzīvnieki Veids: Chordata Klase ... Wikipedia
Vīrusu izolēšana laboratorijas dzīvniekiem.
Laboratorijas dzīvnieku izvēle ir atkarīga no vīrusa veida. Laboratorijas dzīvnieki ir bioloģisks modelis. Dažreiz ir jāveic 3-5 “aklas”, asimptomātiskas pasāžas, pirms vīrusu var pielāgot laboratorijas apstākļiem. Tomēr laboratorijas dzīvnieki nav jutīgi pret dažiem vīrusiem, un tādā gadījumā ir jāizmanto dabiski uzņēmīgi dzīvnieki. Kā, piemēram, ar cūku mēri un zirgu infekciozo anēmiju.
Laboratorijas dzīvnieku inficēšanas mērķis:
1. Izpētīt slimības patoģenēzi;
2. Izolēt vīrusu no patogēnā materiāla;
3. Imūno un hiperimūno serumu ražošana;
4. Vakcīnu ražošana;
5. Vīrusu uzturēšana laboratorijas apstākļos;
6. Titrēšana, lai noteiktu vīrusa daudzumu tilpuma vienībā;
7. Bioloģiskais modelis neitralizācijas reakcijas inscenēšanai;
Laboratorijas dzīvnieku inficēšanas metodes izvēle ir atkarīga no vīrusa tropisma. Tādējādi, kultivējot neirotropos vīrusus, dzīvnieki tiek inficēti smadzenēs; elpošanas intranazāli, intratraheāli; dermatropisks - subkutāni un intradermāli.
Infekcija tiek veikta, ievērojot aseptikas un antiseptikas noteikumus.
Ir daudz veidu, kā dzīvnieku ķermenī ievadīt vīrusu saturošu materiālu:
Subkutāni; - intracerebrāls; - Intradermāls;
Intraperitoneāls; - Intramuskulāri; - Intraokulārs;
Intravenozi; - Intranazāli; - Uztura;
Pēc inficēšanās dzīvniekus apzīmē, ievieto izolētā kastē un uzrauga 10 dienas. Dzīvnieka nāve pirmajā dienā pēc inficēšanās tiek uzskatīta par nespecifisku un vēlāk netiek ņemta vērā.
3 pazīmes liecina par infekcijas efektivitāti:
Klīnisko pazīmju klātbūtne
Dzīvnieka nāve
Patoanatomiskas izmaiņas (orgāna izmērs, forma, krāsa un konsistence).
Vistas embrijs ir apaugļota vistas ola, kurā attīstās embrijs (embrijs). Vīrusu audzēšana uz vistu un paipalu embrijiem pēdējā laikā ir kļuvusi plaši izplatīta kā viena no vienkāršākajām un uzticamākajām metodēm daudzu vīrusu un dažu baktēriju - Brucella, Rickettsia, Vibrio - kultivēšanai un diagnosticēšanai.
Daudzus cilvēku un dzīvnieku vīrusus var kultivēt vistu embriju attīstībā. Embrionālie audi, īpaši embrija membrānas, kas ir bagāti ar dīgļu epitēlija audiem, ir labvēlīga vide daudzu vīrusu vairošanai. Vīrusi ar epiteliotropām īpašībām (bakas, ILT u.c.) veiksmīgi attīstās uz horioalantoīdās membrānas, izraisot makroskopiski redzamas izmaiņas. Dažādi miksovīrusu (gripa, Ņūkāslas slimība, suņu mēra u.c.), infekciozā bronhīta vīrusi, pīļu hepatīts, arbovīrusi u.c. pārstāvji labi vairojas embrijā, ja materiāls tiek ievadīts alantoiskā dobumā. Dažus vīrusus var veiksmīgi kultivēt dzeltenuma maisiņā.
Priekšrocības:
1. Ekonomiski izdevīgi, turklāt olas ir viegli pieejamas;
2. Attīstošiem vistu embrijiem trūkst aizsargmehānismu, jo imūnsistēma vēl nav izveidota;
3. Olu čaumalas neļauj caur to iekļūt baktērijām un vīrusiem no vides;
Lai kultivētu un izolētu vīrusus uz vistu embrijiem, ir nepieciešams ļoti vienkāršs aprīkojums - parasts termostats vai inkubators.
Nosacījumi:
1. Olas iegūst no saimniecībām, par kurām zināms, ka tās ir brīvas no infekcijas slimībām;
2. Vistu embrijus labāk iegūt no balto šķirņu cāļiem (Leghorn, Russian White), jo tie ir izturīgāki pret manipulācijām un nemirst no nelielām traumām. Turklāt to apvalks ir balts un caurspīdīgāks nekā citām šķirnēm, kā arī vieglāk pārskatāms, kas ir ērti apskatei un novērošanai, strādājot ar tiem;
3. Inkubācijai izvēlas apaugļotas olas, kas izdētas ne vairāk kā pirms 10 dienām;
4. Ņemiet nepiesārņotas olas, jo tās pirms inkubācijas nevar nomazgāt, un netīrās olas ir mazāk redzamas skatoties (ovoskopija) un, strādājot ar tām, manipulācijas procesā embrijs var tikt inficēts;
Olas inkubē inkubatorā vai termostatā ar ūdens sildīšanu un gaisa piekļuvi, un inkubācijas laikā termostatā olas ir jāapgriež 2-3 reizes dienā un labākai gāzu apmaiņai jāizņem uz 5-10. minūtes gaisā. Lai uzturētu noteiktu mitrumu, termostatā iztvaicēšanai ievieto trauku ar ūdeni, temperatūrai termostatā jābūt 38°.
Embrija attīstība notiek jau pirmajā inkubācijas dienā, notiek smadzeņu un skeleta dēšana. Vistas embrija uzbūve 7-9 dienu vecumā(skat. piezīmju grāmatiņu).
Infekcijai visbiežāk izmanto 7-12 dienas vecus embrijus. Darbs ar vistu embrijiem tiek veikts sterilā telpā-kastē, stingri ievērojot aseptiku.
Vistas embriju inficēšanas mērķis ir:
1. Izolējiet oderi no patentējamā materiāla;
2. Vakcīnu izstrāde;
3. Vīrusa uzturēšana laboratorijā;
4. Vīrusu titrēšana;
5. Bioloģiskais modelis neitralizācijas reakcijas inscenēšanai;
6. Vīrusu interferences un interferona ražošanas izpēte; Vistas embriju infekcija:
Infekcijai ir jāizvēlas dzīvotspējīgi embriji ar skaidri noteiktu kustīgumu. Pirms inficēšanās visus embrijus rūpīgi pārbauda aptumšotā telpā, izmantojot ovoskopu.
Embriju svecināšanas laikā pirms inficēšanās uz čaumalas ar vienkāršu zīmuli tiek iezīmēta puga (gaisa dobums), lielo asinsvadu gaita un embrija parādīšanās vieta, t.i., vieta uz čaumalas, kur embrijs atrodas vistuvāk. to. Pēc tam mopša marķējums, embrija parādīšanās vieta un lielo asinsvadu gaita kalpo kā ceļvedis, izvēloties vietu vīrusu saturošā materiāla ievadīšanai inficēšanās brīdī.
Inficēšanai atlasītie vistas embriji tiek pārnesti uz kasti, kur tie tiek apstrādāti. Pirms inficēšanās čaumalu materiāla ievadīšanas vietā divreiz apstrādā ar jodētu spirtu un sadedzina. Infekcijas deva ir 0,1-0,2 cm.
Atkarībā no vīrusa veida un infekcijas mērķa tie ir dažādi vīrusu saturoša materiāla ievadīšanas metodes:
1) Horioalantoiskās membrānas infekcija , embriji 7-12 dienu vecumā tiek izmantoti neirotropo, dermatropo un dažu pantropisko vīrusu (bakas, encefalomielīts, ILT, mutes un nagu sērga, trakumsērga, mēris u.c.) izolēšanai un kultivēšanai. Ir 3 infekcijas iespējas:
a) atveriet pugu un nogrieziet to ar šķērēm, atdaliet apakščaulas membrānu un uzklājiet materiālu uz horioalantoiskās membrānas (CAO). Pēc tam caurumu olā aizzīmogo ar sterilu stikla vāciņu un vāciņa malas novasko;
b) ar adatas vīli (vīli) vai zobainu skalpeli čaumalā izgriež trīsstūri, kura malas garums ir aptuveni 1 cm pie pudžas robežas embrija noformēšanas pusē, noņem čaumalas daļu un zemzvaigžņu membrānu ar pinceti un ievadiet materiālu. Caurums ir pārklāts ar sterilu pārklājuma stiklu, un malas ir parafinētas vai aizzīmogotas ar sterilu līmlenti.
c) embrija uzrādīšanas vietā ar skalpeli tiek noņemts neliels čaumalas laukums apmēram 0,5 cm platībā, pēc tam ar pinceti vai adatu šajā vietā tiek noņemta apakščaumalas membrāna un materiāls tiek injicēts. Ja materiāls labi neiederas olas dobumā, ar gumijas spuldzi var izsūknēt gaisu no olas caur olas čaumalas atveri, kā rezultātā pie olas veidojas mākslīga ola. vieta, kur materiāls tiek ievadīts, un pēc tam materiāls ir viegli ievietojams. Caurums čaulā ir pārklāts ar lipīgu apmetumu vai vaskots.
2) Infekcija alantoiskā dobumā. Šī infekcijas metode ir ļoti vienkārša un tiek izmantota daudzu vīrusu izolēšanai. Infekcijai tiek ņemti 10-11 dienu veci embriji. Ir divas infekcijas iespējas:
a) infekcija tiek veikta caur pugu, to nenogriežot. Izmantojot adatu, izmēra attālumu no pugas augšdaļas līdz pugas robežai, kas atzīmēta ar zīmuli uz čaumalas, un ieduriet adatu līdz norādītajam dziļumam un padziļiniet vēl 0,5 cm, lai caurdurtu horioalantoisko membrānu;
b) materiāls tiek ievietots ar adatu caur punkciju čaumalā embrija pasniegšanas vietā 3-5 mm dziļumā avaskulārā zonā. Caurums čaulā ir pārklāts ar lipīgu apmetumu vai vaskots.
3) Infekcija dzeltenuma maisiņā. Infekcijai tiek izmantoti 5-8 dienu veci embriji. Ir divas infekcijas iespējas:
a) adata tiek ievietota no pudžas malas dzeltenuma maisiņā 45° leņķī pret embrija pasniegšanas vietu ovoskopa kontrolē;
b) olu novieto uz statīva ar embrija prezentācijas punktu uz leju, un adatu ievieto no augšas uz leju embrija virzienā apmēram 1 cm dziļumā.
Injekcijas vieta ir aizzīmogota ar līmlenti un parafinēta. 4) Infekcija amnija dobumā. Izmantojot šo infekcijas metodi, vīruss var iekļūt un vairoties dažādās šūnās, kas saskaras ar amnija šķidrumu. Lai atvieglotu inficēšanos, embrijus ieteicams inkubēt 2-3 dienas pirms inficēšanās ar mopsi uz augšu. Tad embrijs un amnions virzās uz augšu, un ir ērtāk inficēties. Ir divas infekcijas iespējas:
a) atveriet un nogrieziet pugu, ar pinceti noņemiet apakščaulas membrānu un satveriet amnionu, ar pinceti pavelciet amniju un ievadiet amnija dobumā materiālu 0,1 ml devā. Pēc tam čaulas caurumu aizzīmogo ar sterilu stikla vāciņu un malas vasko;
b) inficēšanās, izmantojot garu adatu caur pugu tumšā telpā acu kontrolē.Adas galu vispirms saliek taisnā leņķī, lai izveidotu nelielu laukumu. Adata tiek ievietota acs kontrolē caur pirmsembrija izciļņiem; šajā gadījumā, zem strupas adatas spiediena, embrijs izkustēsies, pēc tam ar vieglu spiedienu tiek caurdurts amnions un adata ir nedaudz nospiesta. atvilka atpakaļ. Šajā gadījumā embrijam vajadzētu virzīties uz augšu aiz adatas. Pēc tam tiek ieviests materiāls.
5) Infekcija embrija ķermenī un infekcija smadzenēs. Tiek izmantoti 7-12 dienu veci embriji, infekcija tiek veikta, ievadot materiālu dažādās ķermeņa daļās vai tieši smadzenēs. Infekcijai puga tiek atvērta un embrijs tiek izvilkts ar pinceti. Izmantojot šīs infekcijas metodes, līdz 30% vai vairāk no inficēto embriju skaita var nomirt no ievainojumiem.
6) Infekcija lielos horioalantoiskās membrānas asinsvados. Šo infekcijas metodi, tāpat kā iepriekšējo, izmanto ļoti reti. Materiālu injicē ar tievu adatu pēc čaumalas noņemšanas gar asinsvadu tieši traukā pa asins plūsmu.
Pēc inficēšanās vistas embriji ir jāmarķē ar vienkāršu zīmuli un jāievieto termostatā. Tos uzrauga katru dienu apskatot, novērošana tiek veikta līdz 7-8 dienām atkarībā no vīrusa veida. Ja embriji nomirst, tos nekavējoties izņem no termostata un ievieto ledusskapī līdz atvēršanai. Ja embrijs nomirst pirmo 14-18 stundu laikā, tas var būt saistīts ar traumu vai patoloģiskā materiāla toksicitāti. Tāpēc, tāpat kā inficējot laboratorijas dzīvniekus, šaubīgos gadījumos ieteicams veikt vairākas pasāžas un paņemt vairākus embrijus katram materiālam.
Mirušo inficēto vistu embriju vai to embriju, kas izņemti pēc novērošanas perioda beigām, autopsija tiek veikta, ievērojot visus aseptikas noteikumus sterilos boksa apstākļos. Atverot čaulu apstrādā ar spirtu un sadedzina, tad pugu nogriež. No atvērtā embrija vispirms rūpīgi izsūc alantoju (tā daudzums ir aptuveni 7 ml), pēc tam ar pinceti atvelk augļa plēvi, caurdur ar Pastēra pipeti un izsūc amnija šķidrumu (tā daudzums 1,0- 1,5 ml), pēc tam savāc dzeltenumu, noņem membrānas un embriju. Šķidrums, membrānas un pats embrijs tiek rūpīgi pārbaudīti, lai noteiktu izmaiņas. Amnija šķidrums parasti ir pilnīgi dzidrs, bet inficēts var būt duļķains un asiņains. Raksturīgās vīrusa izraisītās izmaiņas visspilgtāk izpaužas uz horioalantoīdās membrānas: parādās iekaisuma perēkļi, necaurspīdīgi, apaļas formas un asinsizplūdumi. Uz embrija ķermeņa var rasties asiņošana. Viss materiāls tiek savākts sterilos traukos.
Vistas embrijus virusoloģijā plaši izmanto ne tikai vīrusu izolēšanai, bet arī antigēnu uzkrāšanai un iegūšanai, dzīvu un nogalinātu vakcīnu sagatavošanai, vīrusu titrēšanai, vīrusu neitralizācijas reakcijas inscenēšanai, vīrusu novājināšanai, vīrusu traucējumu izpētei. vīrusi un interferona iegūšana.
Raksti par tēmu
