Лабораторные методы диагностики спида. Диагностика ВИЧ: методы исследования, сроки выполнения анализов Для диагностики вич инфекции применяют
Инфекция «вирус иммунодефицита человека» - ВИЧ , представляет собой вирусное заболевание. Оно постепенно разрушает определенные лейкоциты и может вызвать синдром приобретенного иммунодефицита - СПИДа.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится к типу ретровирусов.
- Что такое ретровирус?
- Лабораторная диагностика ВИЧ
- Бессимптомная фаза
- Стадия начала СПИДа
- Методы диагностики ВИЧ
- ПЦР (полимеразная реакция)
- Экспресс-тестирование
- Сроки и цена диагностики ВИЧ
Что такое ретровирус?
Представляет собой геномный ДНК и хранит генетическую информацию не только как ДНК (большинство других организмов использует только ДНК), но и как РНК (рибонуклеиновая кислота).
На сегодня принято разделять следующие пути инфицирования ВИЧ:
- половой контакт без использования средств защиты
- перинатальный путь заражения (наблюдается у детей)
- в ходе гемотрансфузии (переливания крови)
- при использовании зараженных шприцев (чаще у инъекционных наркозависимых больных)
Когда ВИЧ проникает в клетки человека, он высвобождает рибонуклеиновую кислоту и реплицирует (копирует) ДНК из РНК ВИЧ с помощью фермента, называемого обратной транскриптазой.
Образовавшаяся ДНК включается в ДНК инфицированных клеток. Этот процесс является обратным, так как задействованы человеческие клетки для репликации РНК и ДНК.
Другие вирусы (инфекции) РНК, такие как полиовирус, вирус гриппа, вирус кори, в отличие от ретровируса не производят репликации ДНК после проникновения в клетку. Эти вирусы производят реплики рибонуклеиновой кислоты исходной РНК.
В ВИЧ-инфицированных клетках каждый раз, когда происходит деление клеток, ДНК интегрированного ВИЧ также реплицируется в дополнение к собственной ДНК клетки.
Репликация ДНК ВИЧ находится в одном из следующих состояний:
- Неактивное (скрытое) состояние: вирус существует, но не оказывает пагубного воздействия на организм человека
- Состояние активации: вирус доминирует над функцией инфицированных клеток, он производит большое количество новых репликаций ВИЧ, которые поражают другие клетки организма, провоцируя состояние стойкого приобретенного иммунодефицита
Важным аспектом терапевтического воздействия остается точная и своевременная диагностика заболевания.
Первые лабораторные исследования ВИЧ- патологии проводились более тридцати пяти лет назад.
Современная диагностика включает использование иммунологических, гематологических и молекулярных методов обнаружения вирусного патогена. Используемые тест-системы прошлого столетия имели достаточно ограниченные возможности и определяли ретровирус первого типа.
Их технические возможности не выходили за рамки определения иммуноглобулина G.
По мере развития лабораторной диагностики и усовершенствования методик исследования появилась возможность обнаружения обоих типов вируса.
Появление систем тестирования третьего поколения значительно расширило диагностические возможности.
Теперь обнаружение вируса 1-2 типа возможно уже спустя несколько недель после инфицирования. Такая современная диагностика позволяет быстро назначить антиретровирусное лечение.
В десятки раз сокращает риск развития более тяжелой стадии вируса - СПИД. К последним изобретениям можно отнести системы тестирования 4 поколения. Они являющиеся комбинированными методами исследования.
Система используется для обнаружения антител к ВИЧ обоих типов и одновременного выявления антигена р24 (белка стенки эфира нуклеозидов ретровируса). Такие возможности тест-систем 4 поколения сокращают время «серологического окна» минимум на неделю. (Это период наличия в организме ВИЧ еще без появления антител).
Лабораторная диагностика ВИЧ
Проведение лабораторных анализов является основным аспектом диагностирования ВИЧ-заболевания и назначения адекватной терапии. Кроме того, диагностика является мониторингом качества лечения и состояния здоровья пациента.
Регулярное проведение лабораторных анализов дает возможность:
- контролировать течение инфекционного процесса
- корректировать схему терапии
- проводить мониторинг побочных реакций от приема медикаментозных средств
Стандартный анализ на ВИЧ подразумевает исследование крови пациента.
Основной биологический материал - венозная кровь, забор которой проводится утром, до приема пищи.
Предварительной, особой подготовки от пациента не требуется.
Основной подготовкой является исключение приема алкоголя за несколько дней. При возможности прекращение приема антибиотиков и противовирусных средств за 5-7 дней до анализа.
Клинико-иммунологическая экспертиза может проводиться в государственной поликлинике. Но в таком случае потребуется направление от врача-терапевта или семейного доктора.
Сегодня все чаще практикуется диагностика ВИЧ, СПИДа и ЗППП в независимых лабораторных центрах, где имеется возможность сдать анализ анонимно.
В ходе диагностики пациенту присваивается особый номер, известный только ему и персоналу учреждения. Однако в данном случае имеется определенный минус.
Результаты тестирования не могут быть переданы в клинику для последующей госпитализации больного. Не предоставляются гинекологу/венерологу/ инфекционисту, не могут быть занесены в реестр инфекционных патологий (ОРУИБ).
Клиника заболевания: как себя проявляет ретровирус
Основной способ передачи ВИЧ-заболевания:
- половой контакт
- от матери к ребенку (трансплацентарно, через родовой путь, грудное молоко)
- в ходе процедуры переливания крови, трансплантации органа
- при введении внутривенных наркотиков нестерильным шприцем
Другими словами, до тех пор, пока нет контакта с кровью или жидкостями организма, вероятность инфицирования ВИЧ в повседневной жизни почти равна нулю.
Количество вируса, содержащегося в секреторной жидкости, такой как слюна или слезы, очень мало. Даже если вирус находится в данных выделениях, то до сих пор не сообщалось о заражении при использовании общей ванны или полотенца.
ВИЧ является достаточно «хрупким» вирусом, который инактивируется, как только он попадает из организма во внешнюю среду. Клинические проявления патологического процесса зависят от стадийности инфекции.
Начальная стадия инфекции (острая фаза)
Первое проявление инфекции наблюдается спустя 2-3 недели после заражения.
В этот период симптомы ВИЧ такие: лихорадка, боль в горле, мышечная боль, сыпь, лимфаденопатия, головная боль, усталость и т. д. Появляются симптомы гриппа или ангины (как правило, моноцитарного типа).
Ранние признаки болезни могут сопровождать пациента от нескольких дней до месяца и более, во многих случаях спонтанно исчезают.
Диагностировать заболевание в данный период считается максимально выгодным для больного. Лечение антиретровирусными препаратами на начальном этапе инфекции показывает наиболее положительные результаты.
Важно! Пациентам, имеющим любые инфекции, передающиеся половым путем (сифилис, гонорея, ВПЧ, хламидии и т. д.) в обязательном порядке рекомендуется сдача анализа на ВИЧ. У больных ретровирусом довольно часто выявляют параллельное течение ЗППП.
Бессимптомная фаза
Количество вируса в крови, достигшего пика из-за иммунного ответа (индукция ЦТЛ или продуцирование антител) после заражения, снижается до определенного уровня, спустя 6-8 месяцев, и приобретает фазу бессимптомного течения. Подобная фаза может длиться несколько лет.
После чего сменяется периодами обострения: симптомы гриппа, недомогание, увеличение лимфатических узлов. В этот период пациент как никогда уязвим перед другими инфекционными патологиями: ЗППП, гепатит, герпес, туберкулез.
Стадия начала СПИДа
Без анти-ВИЧ-терапии после заражения, инфекция прогрессирует, а CD4-положительные Т-клетки стремительно снижаются. Когда число лимфоцитов CD4 составляет 200 / мм 3 или менее, оппортунистические инфекционные заболевания, такие как пневмония, туберкулез, развиваются с вероятностью в 90%.
Кроме того, если количество лимфоцитов CD4 ниже 50 / мм 3 - высокий шанс развития цитомегаловирусной инфекции, атипичного микобактериоза (в 93% случаев), первичных лимфом ЦНС, злокачественных образований. У больных отмечается резкое снижение аппетита, потеря массы тела вплоть до анорексии, постоянные нарушение дефекации с преобладанием диареи, слабость и тому подобное.
Этиология, патогенез, эпидемиология: ВИЧ - вирус из семейства РНК-содержащих патогенов, поражает клетки иммунной системы, провоцирует развитие СПИДа, оппортунистических инфекций, онкологию. Согласно статистическим данным, приведенным на 2011 год, в мире зарегистрировано 62 миллиона пациентов с диагнозом ВИЧ.
Пока пациент прибегает к антиретровирусной терапии, можно подавить вирусную нагрузку в значительной мере.
Но, к сожалению, полностью ликвидировать вирус из организма невозможно. Поэтому крайне важно как можно быстрее диагностировать заболевание и начать соответствующее лечение.
Методы диагностики ВИЧ
Диагностические мероприятия по выявлению ВИЧ-инфекции включают два этапа:
- выявление факта заражения (наличие в организме ретровируса)
- определение стадии процесса (как давно произошло инфицирование и как сильно поражены клетки иммунной системы)
Результаты диагностики позволят определиться с тактикой терапии и спрогнозировать дальнейшее течение болезни.
Существуют различные серологические методики выявления инфекционных, вирусных и бактериальных патологий. При диагностировании ВИЧ, как правило, применяются следующие серологические анализы.
ИФА (иммуноферментный анализ)
Является наиболее часто назначаемым анализом при необходимости подтвердить/опровергнуть наличие в организме ретровируса.
Анализ основан на определение антител к вирусу, которые образуются в ходе попадания патогена в организм человека. Информативность диагностического метода достигает 96%.
Однако, если исследование проводится на этапе еще отсутствия антител, можно получить ложноположительный результат. В таком случае назначается повторное исследование ИФА через 2-3 месяца.
Но гораздо целесообразней проведение ПЦР-анализа, способного выявить заражение на самых ранних сроках.
Также получить ложноположительный результат можно при наличии у пациента:
- патологий аутоиммунного характера
- инфекций, протекающих в хронической форме
- заболеваний онкологического типа
В другом случае, данный результат может быть получен при наличии ранних сроков беременности.
Иммунный блотинг (Western Blot)
Специфика анализа направлена на выявление белков ВИЧ-инфекции.
Как правило, диагностика проводится в качестве подтверждающего теста. При положительном результате дает возможность поставить окончательный диагноз «вирус иммунодефицита человека».
Стандартно иммуноблоттинг выдает три варианта результата: положительно, отрицательно, сомнительно. В первых двух случаях расшифровка проста - ВИЧ отсутствует/присутствует.
Сомнительный вариант, как правило, означает присутствие в организме ВИЧ. Но с инфицированием не более трех месяцев назад, когда организм не успел выработать весь спектр антител.
Также, получение сомнительного результата свойственно для пациентов с туберкулезом, злокачественными патологиями, прошедших многократные манипуляции по переливанию крови.
ПЦР (полимеразная реакция)
Суть метода заключается в определении ДНК вируса и его РНК. Является наиболее информативным и точным методом обнаружения патогена.
Может обнаружить ВИЧ на ранних сроках инфицирования, еще до образования антител к ретровирусу. Чувствительность ПЦР составляет 99%, получить ложный результат практически невозможно.
Полимеразная реакция назначается пациенту с целью:
- указать присутствие или отсутствие вируса ВИЧ в организме человека при сомнительных результатах, полученных в ходе других лабораторных тестов
- идентификации типа ретровируса (ВИЧ-1, ВИЧ-2), а также для установления нагрузки на организм, спровоцированной вирусом
- установления статуса рожденного ребенка от матери, имеющей заболевание
- выявления патогена в крови, которая в дальнейшем будет использована для переливания
ПЦР является наиболее точным анализом, способным выявить ретровирус спустя 7-10 дней после попадания в организм.
При этом точность результата на данном сроке будет составлять 98-99%.
Однако, ПЦР имеет некоторые особенности, по этой причине может назначаться несколько раз. В связи с высокой чувствительностью анализ способен реагировать не только на ретровирус. Но и на самые незначительные инфекционные процессы, происходящие в организме. Поэтому окончательный диагноз после одноразового проведения полимеразной реакции не ставится.
Следующая особенность ПЦР - необходимость современной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому анализ не проводится в государственных клиниках. Осуществляется тестирование в современных лабораториях, где стоимость анализа может стартовать от 1000 рублей.
Экспресс-тестирование
Назначается в экстренных ситуациях, когда срочно требуется проведение оперативного вмешательства.
Биологическим материалом для исследования является моча. Экспресс-тест, по мнению некоторых специалистов, имеет точность до 96%, но, тем не менее, является дополнительным тестированием. На основании полученных результатов данного исследования, диагноз не ставится.
В обязательном случае проводится ИФА или ПЦР.
Сроки и цена диагностики ВИЧ
Через какое время можно получить готовый анализ?
Ответ лабораторного центра о результатах анализа можно получить спустя несколько дней, в зависимости от загруженности учреждения.
Также во многих центра имеется дополнительного услуга «срочное тестирование», что позволяет получить результат спустя несколько часов.
Относительно ценовой политики, то стоимость будет зависеть от выбранной лаборатории и методики исследования.
Так, стоимость может стартовать от 500 рублей и достигать 10 000-15 000.
Цена Western Blot стартует от 2500 рублей и может достигать 3000-4000. Получить готовый результат можно спустя 2-5 дней.
Если проводится ПЦР в реальном времени с определением обоих типов ретровируса, а также их РНК и ДНК, стоимость может достигать 5000 рублей и выше. Длительность диагностирования от 5 до 10 дней.
Согласно действующему закону РФ, иммунологические исследования, проводимые в государственных учреждениях, предоставляются на бесплатной основе. Анализ на ВИЧ в обязательном порядке назначается пациенткам в период беременности, больным в предоперационный период, донорам органов или части ткани.
/ 16
ХудшийЛучший
Обследованию на ВИЧ-инфекцию подлежат:
2. Лица с подозрением или подтвержденным диагнозом: бактериальной инфекции у детей младше 13 лет, множественной и рецидивирующей; кандидоза пищевода, трахеи, бронхов или легких; цервикального инвазивного рака; диссеминированного или внелегочного кокцидиомикоза; криптококкоза внелегочного; криптоспоридиоза с диареей в течение 1 мес и более; цитомегаловирусного поражения других органов, кроме печени, селезенки, лимфатических узлов у больных старше 1 мес; цитомегаловирусного ретинита с потерей зрения; герпетической инфекции, вызывающей многоочаговые язвы, которые не излечиваются на протяжении 1 мес, или бронхит, пневмонию, эзофагит; гистоплазмоза диссеминированного или внелегочного; изоспороза с диареей свыше 1 мес; туберкулеза распространенного или внелегочного; туберкулеза легких у взрослых или подростков старше 13 лет; туберкулеза внелегочного; другого заболевания, вызванного микобактериями, кроме М. tuberculosis диссеминированного или внелегочного; пневмонии, вызванной пневмоцистами; прогрессирующей многофокусной лейкоэнцефалопатии; сальмонеллезной (кроме Salmonella typhi) септицемии, рецидивирующей; токсоилаз-моза мозга у детей старше 1 мес; саркомы Капоши; лимфоидной интерстициальной пневмонии у детей младше 13 лет; лимфомы Беркитта; иммунобластной лимфомы; первичной лимфомы мозга; синдрома истощения, гепатита В, носительства HBsAg; инфекционного мононуклеоза; рецидивирующего опоясывающего герпеса у лиц старше 60 лет; болезней, передающихся половым путем.
В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:
а) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;
б) оценка функций клеточного звена иммунной системы. Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.
Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:
а) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;
б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;
в) диагностики ВИЧ-инфекции, т. е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.
Система проведения лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции построена по трехэтапному принципу. Первый этап - скрининговый, предназначен для выполнения первичных исследований крови на наличие антител к белкам ВИЧ. Второй этап референтный - позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить (подтвердить) первичный положительный результат, полученный на скрининговом этапе. Третий этан - экспертный, предназначен для окончательной проверки наличия и специфичности маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики. Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями.
В практике применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
ИФА (ELISA)-тecт (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими;
Иммунный блот (Western-blot), весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ - 2;
Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100. Если смесь сыворо-ток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.
При первичной серодиагностике ВИЧ-инфекции проводится определение суммарных антител с помощью скрининговых отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций. На втором (арбитражном) этапе используют более сложный тест - иммуноблот, позволяющий не только подтвердить или отклонить первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является основным и наиболее широко применяемым методом определения антител к ВИЧ. Но к недостаткам применения ИФА в серодиагностике ВИЧ-инфекции следует отнести частые ложноположительные результаты. В связи с этим результат в ИФА не является основанием для заключения о ВИЧ-серопозитивности обследуемого. Это связано с недостаточной очисткой иммуносорбента от балластных белков; спонтанным связыванием антител сыворотки с пластиком, если его участки, не занятые иммуносорбентом, недостаточно блокированы или не блокированы совсем специальным нейтральным белком; перекрестным взаимодействием с ВИЧ-белками иммуносорбента различных протеинов, присутствующих в крови лиц с определенными, чаще аутоиммунными патологическими процессами типа рассеянного склероза, СКВ, туберкулеза; с частым донорством, инфекционными и онкозаболеваниями, ожогами, беременностью, повторными гемотрансфузиями, пересадкой органов, тканей, а также лиц, находящихся на гемодиализе; с присутствием в крови ревматоидного фактора, часто провоцирующего ВИЧ-ложноположительные реакции; наличием в крови обследуемых людей антител к gag-белкам ВИЧ и прежде всего к белку р24 (очевидно, образуются антитела к экзо-или эндогенным не идентифицированным еще ретровирусам). Так как анти-р24 синтезируются в обязательном порядке на ранних стадиях ВИЧ-сероконверсии, проводится дальнейшее иммунологическое наблюдение за лицами с антителами к gag-белкам ВИЧ, а также отстранение их от донорства.
Чувствительность и специфичность иммуноферментно-го анализа постоянно повышаются. В результате ИФА четвертого поколения не уступают по своим диагностическим возможностям иммунному блотингу и могут быть использованы не только на скрининговом, но и на подтверждающем этапе диагностики ВИЧ-инфекции [Смольская Т. Т., 1997].
Иммуноблотинг является конечным методом серологической диагностики, позволяющим сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности или негативности обследуемого.
Существует четкая корреляция между результатами исследования сывороток в иммуноблоте и ИФА - дважды положительные в ИФА с разными тест-системами сыворотки в 97-98% случаев оказываются затем ВИЧ-позитивными в иммуноблотинге. Если же сыворотки оказались положительными в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-систем, в иммуноблоте они выявляются положительными лишь в 4% случаев. В 5% случаев при проведении подтверждающих исследований у лиц с положительными данными ИФА-иммуноблот может давать «неопределенные» результаты, а среди них примерно в 20% случаев «неопределенные» результаты вызывают антитела к gag-белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). Наличие антител только к gag-белкам ВИЧ-1 является поводом для дополнительного обследования сыворотки крови на инфицирование ВИЧ-2.
Оценка результатов иммуноблотинга осуществляется строго в соответствии с прилагаемой к тест-системе инструкцией. В случае отсутствия в инструкции указаний по интерпретации результатов следует использовать критерии ВОЗ.
При получении положительных результатов исследований на референтном этапе лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и отрицательном результате исследования методом иммунного блотинга проводится обязательная повторная экспертная диагностика через 6 мес после первого обследования.
Если результаты иммуноблотинга через 12 мес после исследования первой пробы остаются отрицательными или неопределенными, то при отсутствии факторов риска, клинических симптомов или других факторов, связанных с ВИЧ-инфицированием, обследуемого снимают с диспансерного наблюдения.
Среди серологических методов в случае неопределенных результатов иммуноблота используется в качестве экспертной диагностики радиоиммунопреципитация (РИП). В основе ее лежит использование белков вируса, меченных радиоактивным йодом, а преципитаты выявляются с помощью бета-счетчиков. К недостаткам метода относится дороговизна аппаратуры, необходимость оборудования для этих целей специальных помещений.
Лица, у которых диагностирована ВИЧ-инфекция, подлежат постоянному динамическому наблюдению с обязательным лабораторным обследованием каждые 6 мес.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет предварительно умноженные нуклеотидные последовательнос-ти, специфичные для генома данного возбудителя. Изолированное умножение гена или его фрагмента, называемое амплификацией, ПЦР дает возможность осуществлять в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы. За 2-3 часа ПЦР позволяет получить миллионы копий специфического участка вируса. При ВИЧ-инфекции из клеточной РНК, включающей и РНК вируса, если он репродуцировался в клетке или был интегрирован в ее геном, с помощью обратной транскрипции и гибридизации с мечеными олигонуклеотидными «зондами» получают достаточное для анализа количество провирусной ДНК, которую выявляют и характеризуют количественно, как и в отношении принадлежности к геному ВИЧ, по радиоактивной или иной метке зонда устанавливая гомологию ДНК и специфических для вируса аминокислотных последовательностей. Чувствительность ПЦР - обнаружение вирусных генов в одной из пяти тысяч клеток.
ПЦР, в том числе количественная, может быть исполь-зовна только в целях определения вирусной нагрузки на плазму для решения вопроса начала медикаментозного лечения больного или смены антиретровирусных лекарственных препаратов. ПЦР не может быть рекомендована для постановки диагноза ВИЧ-инфекции, так как даже самые ультрасовременные методы ее постановки и реактивы позволяют определить вирусную нагрузку не ниже определенного уровня - 50 копий/мл. А сложность постановки ПЦР и ее дороговизна (около 200 долларов) сводят на нет ее широкомасштабное использование как метода повседневной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Таким образом, ПЦР остается незаменимой только для оценки вирусной нагрузки на плазму у больных с уже установленным диагнозом ВИЧ-инфекции в целях решения вопроса терапии больных.
Схематично этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции представлены на рис. 1.
Рис. 1. Этапы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
В течение ВИЧ-инфекции существует период «темного лабораторного окна», когда количество антител против ВИЧ является недостаточным для чувствительности тест-систем. Период этот колеблется от одной недели до трех месяцев от момента заражения ВИЧ в зависимости от уровня чувствительности тест-системы. С учетом этого явления возникают сложности при обследовании донорской крови от лиц, пребывающих в упомянутом периоде ВИЧ-инфицирования. Поэтому в большинстве стран мира введена система использования крови только после ее хранения на протяжении 3-6 мес с целью осуществления обязательного повторного обследования на ВИЧ-инфекцию доноров данных доз крови и ее компонентов.
Стадия первичных проявлений характеризуется активностью репликативного процесса. Возникающие виремия и антигенемия вызывают образование специфических антител класса IgM: анти-р24, aнти-gp41, aнти-gp120. Антиген р24 у части инфицированных может быть выявлен в крови методом ИФА уже через 2 нед после заражения и определяться до 8-н недели. Далее в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24, он приходится на период формирования стадии СПИД.
Появление полной сероконверсии, когда в периферической крови регистрируется высокий уровень специфических антител класса IgG к структурным белкам ВИЧ gp41, р24, gpl20, существенно облегчает диагностику ВИЧ-инфекции. Большинство коммерческих наборов рассчитано на индикацию именно таких антител.
Трудности с выявлением антител у больных ВИЧ-инфекцией могут возникнуть в периоды массивной виремии и антигенемии, когда имеющиеся специфические антитела в крови израсходованы на связывание вирусных частиц, и репликативный процесс опережает наработку новых противовирусных антител.
У лиц с исходно ослабленной иммунной системой виремия и антигенемия появляются раньше и сохраняются на высоком уровне до исхода заболевания. Вместе с тем у таких больных отмечается низкое содержание свободных антител к ВИЧ, обусловленное двумя причинами - недостаточной продукцией антител В-лимфоцитами и связыванием антителами вирионов и растворимых белков ВИЧ, поэтому для определения инфицированности требуются тест-системы с повышенной чувствительностью или модификации методов анализа, предусматривающие этап высвобождения антител из иммунных комплексов.
Несмотря на обилие специфических маркеров ВИЧ-инфекции, наиболее часто определяемым является наличие суммарных антител к белкам ВИЧ. Термин «суммарный» подразумевает присутствие двух классов антител (IgG и IgM) и широкий спектр антител к различным, в первую очередь к структурным, белкам ВИЧ.
Определение СD4-клеток. Основным клинико-лабораторным показателем диагностики стадии ВИЧ-инфекции, степени разрушения иммунной системы у больных в повседневной жизни стало определение содержания CD4+-лимфоцитов: уменьшение уровня ниже 200 клеток/мм3 является основным критерием постановки диагноза СПИД. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством CD4+-лимфоцитов 200 клеток/мм3 и ниже нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. И хотя у 1/3 ВИЧ-инфицированных с количеством С04+-лимфоцитов менее 200 клеток/мм3 отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что у них симптомы развиваются в ближайшие 2 мес, поэтому они все расцениваются как больные на стадии СПИДа.
1. Серологические методы обнаружения антител (АТ) к ВИЧ - стандарт при диагностике ВИЧ-инфекции (тест-системы ИФА на основе синтетических пептидов - обладают практически 100% чувствительностью и специфичностью). ИФА позволяет выявлять АГ ВИЧ, которые могут являться показателями раннего инфицирования или наоборот позднего - продвинутого развития ВИЧ-инфекции (р24 АГ)
2. Подтверждающие тесты - иммуноблотинг (ИБ), непрямая иммунофлюоресценция (НИФ) и радиоиммунопреципитация (РИП).
а) ВОЗ рекомендует считать положительной сыворотку, имеющую в ИБ антитела к двум оболочечным белкам и к одному из внутренних белков ВИЧ. Пациенты, положительные в ИФА, но имеющие неопределенные результаты в ИБ, должны быть обследованы клинически и оценены другими способами, медицинским обследованием, иммунологически и через 3 - 6 месяцев их сыворотку крови необходимо тестировать на антитела к ВИЧ.
б) метод непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) - применяют в качестве подтверждающего теста во многих лабораториях или как скрининговый тест.
в) радиоиммунопреципитация - высоко чувствительный и специфичный метод, основанный на использовании меченых радиоактивными изотопами аминокислот. Метод высоко чувствительный для обнаружения антител к поверхностным белкам и поэтому высокоспецифичен, поскольку эти компоненты вируса присутствуют практически у всех ВИЧ-инфицированных после сероконверсии.
3. Молекулярно-биологические методы : метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, ПЦР
ПЦР используют:
1) как альтернативный и дополнительный подтверждающий метод детекции наличия вируса в организме по отношению к серологическим методам лабораторной диагностики;
2) как первый метод специфического анализа при диагностике раннего ВИЧ-инфицирования, когда еще отсутствуют специфические противовирусные антитела;
3) для диагностики ВИЧ-инфицированности новорожденных от ВИЧ-инфицированных матерей;
4) для определения вирусной нагрузки и назначения специфической антиретровирусной терапии и контроля за её проведением;
5) как уточняющий метод при неясных серологических результатах и при несовпадении серологических и культуральных анализов;
6) при исследовании сексуальных партнеров ВИЧ-инфицированных лиц;
7) как метод дифференциальной диагностики ВИЧ-1 и ВИЧ-2;
4. Вирусологический метод .
Лечение ВИЧ-инфекции:
1. Принципы антиретровирусной терапии: лечение должно начинаться до развития существенного иммунодефицита; начальная терапия должна включать комбинации не менее, чем из трех препаратов; модификация терапии должна заключаться в замене или подключении не менее двух новых препаратов; крайне важно измерять уровень СД4+ клеток и вирусную нагрузку; снижение вирусной нагрузки до уровня, лежащего ниже предела определения чувствительных методик, отражает оптимальный эффект лечения.
2. Выделяют три группы современных антиретровирусных препаратов:
а) нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ): зидовудин (азидотимидин, ретровир); диданозин (ddI, видекс); зальцитабин (ddC, хивид); ставудин (зерит, d4Т); ламивудин (3ТС, эпивир); абакавир; адефовир; комбивир (зидовудин+ абакавир); тризивир (зидовудин+ламивудин+абакавир); адефовир(нуклеотидный ингибиторы обратной транскриптазы).
б) ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ): делавердин(рескриптор); невирапин(вирамун); ифавиренц.
в) ингибиторы протеазы (ИП): саквинавир; ритонавир (норвир); индинавир (криксиван); нельфинавир (вирасепт); ампренавир (агенераза); лопинавир (алувиран); калетра(лопинавир+ритонавир).
3. Монотерапия любым препаратом не может обеспечить достаточно выраженного и длительного подавления репликации ВИЧ. Более того, при монотерапии повышен риск появления резистентных штаммов и развития перекрестной устойчивости к препаратам той же группы. Единственным исключением является использование зидовудина в качестве монотерапии для снижения риска перинатальной передачи ВИЧ.
4. Наиболее важным критерием эффективности терапии является динамика вирусной нагрузки, которую следует определять: без лечения - каждые 6-12 мес, на фоне лечения - каждые 3-6 мес, а также через 4-8 недель после начала противовирусной терапии.
Помимо антиретровирусной терапии необходима терапия присоединившихся вторично заболеваний.
34.3 СПИД (клинические варианты, оппортунистические заболевания).
Опортунистические заболевания - тяжелые, прогрессирующие болезни, которые развиваются на фоне нарастающей иммуносупрессии и не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой (СПИД-индикаторные заболевания).
а) первая группа - это заболевания, которые присущи только тяжелому иммунодефициту (уровень СД4+ < 200 кл/мкл) и поэтому определяют клинический диагноз: 1. Кандидоз пищевода, трахеи, бронхов. 2. Внелегочный криптококкоз. 3. Криптоспоридиоз с диареей более 1 месяца. 4. Цитомегаловирусная инфекция с поражением различных органов, помимо печени, селезенки или лимфоузлов. 5. Инфекции, обусловленные вирусом простого герпеса, проявляющиеся язвами на коже и слизистых оболочках. 6. Саркома Капоши у лиц, моложе 60 лет. 7. Первичная лимфома мозга у лиц, моложе 60 лет. 8. Лимфоцитарная интерстициальная пневмония и/или легочная лимфоидная гиперплазия у детей в возрасте до 12 лет. 9. Диссеминированная инфекция, вызванная атипичными микобактериями с внелегочной локализацией. 10. Пневмоцистная пневмония. 11. Прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия. 12. Токсоплазмоз с поражением головного мозга, легких, глаз у больного старше 1 месяца.
б) вторая группа - заболевания, которые могут развиться как на фоне тяжелого иммунодефицита, так и в ряде случаев без него: 1. Бактериальные инфекции, сочетанные или рецидивирующие у детей до 13 лет (более двух случаев за 2 года наблюдения): септицемия, пневмония, менингит, поражения костей или суставов, абсцессы, обусловленные гемофильной палочкой, стрептококками. 2. Кокцидиомикоз диссеминированный (внелегочная локализация). 3. ВИЧ-энцефалопатия 4. Гистоплазмоз, диссеминированный с внелегочной локализацией. 5. Изоспороз с диареей, персистирующей более 1 месяца. 6. Саркома Капоши у людей любого возраста. 7. В-клеточные лимфомы (за исключением болезни Ходжкина) или лимфомы неизвестного иммунофенотипа. 8. Туберкулез внелегочный. 9. Сальмонеллезная септицемия рецидивирующая. 10. ВИЧ-дистрофия.
Наиболее часто встречаются пневмоцистная пневмония, криптококковый менингоэнцефалит, генерализованная цитомегаловирусная инфекция (энцефалит, ретинит, эзофагит, гепатит, колит), сепсис смешанной этиологии, генерализованная форма саркомы Капоши, туберкулез легких.
Все эти заболевания протекают с поражением одного или нескольких органов и систем: головного мозга, легких, печени, желудочно-кишечного тракта и носят тяжелый прогрессирующий характер. СПИД-индикаторные болезни появляются в различных сочетаниях, и даже адекватная терапия не приносит ожидаемого эффекта.
Клинические варианты СПИД : инфекто-, нейро-, онко-СПИД в зависимости от преобладания различной клиники.
Первые предназначены для выявления всех лиц, инфицированных ВИЧ, вторые- для выявления лиц, не инфицированных ВИЧ, но давших положительную реакцию при скрининговом тестировании. Поэтому скрининговые тесты обладают высокой чувствительностью, т. е. почти не дают ложноотрицательных результатов, а подтверждающие тесты обладают высокой специфичностью, т. е. почти не дают ложноположительных результатов. В сочетании эти тесты дают точные и надежные результаты, которые позволяют обнаружить зараженные препараты крови и поставить диагноз ВИЧ-инфекции. Однако существуют биологические факторы, снижающие точность этих тестов; возможны и лабораторные ошибки. Поэтому в каждой лаборатории, проводящей тесты на антитела к ВИЧ, должна быть разработана безупречная программа контроля качества этих тестов. Не надо забывать и о том, что надежность лабораторных исследований никогда не бывает стопроцентной и что их результаты всегда должны расцениваться как дополнение к клиническому диагнозу.
Период окна и выявление ВИЧ-инфекции на ранних сроках заражения:
Антитела к ВИЧ начинают вырабатываться вскоре после заражения, но время их появления зависит от многих факторов, в частности, от состояния иммунной системы пациента и свойств вируса. Важно отметить, что антитела могут присутствовать в крови уже на ранних сроках после заражения, но концентрация их бывает ниже предела чувствительности некоторых методов (период окна). Первые тест-системы выявляли антитела почти у всех ВИЧ-инфицированных через 6–12 недель после заражения. Новейшие тест-системы, в том числе ловушечный ИФА третьего поколения, обнаруживают антитела спустя 3–4 недели после заражения. Срок между заражением и диагнозом ВИЧ-инфекции можно сократить на несколько дней, применяя методы выявления антигенов ВИЧ, и еще на несколько дней, применяя методы выявления РНК ВИЧ. Если использовать все описанные методы, диагноз ВИЧ-инфекции у большинства больных можно установить уже через 2–3 недели после заражения. Имеющиеся в продаже тест-системы для скрининга на антитела к ВИЧ обладают очень высокой и примерно одинаковой чувствительностью, достаточной для выявления большинства ВИЧ-инфицированных (так называемой эпидемиологической чувствительностью). Однако разные тест-системы различаются по аналитической чувствительности, т. е. по способности выявлять низкие уровни антител, которые имеют место до завершения сероконверсии.
Есть тест-системы, предназначенные для выявления IgM-антител к ВИЧ, однако они не нашли широкого применения в ранней диагностике ВИЧ-инфекции, поскольку IgM-антитела не всегда вырабатываются на ранних сроках после заражения. Некоторые тест-системы третьего поколения одновременно выявляют IgM- и IgG-антитела к ВИЧ и обладают более высокой аналитической чувствительностью.
Смотрите также: Раскрытие ВИЧ-статуса без сожалений, Искривление перегородки носа, Аневризма сосудов: скрытая угроза здоровью, Пренатальный скрининг; хромосомные аномалии, Скрытое косоглазие (Strabismus latenta, Heterophoria), Скрытый риск: женщины и заболевания сердца, Скрытый сифилис (Syphilis latens), Протокол полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ, Realtime RT-PCR) CDC для выявления и исследования вируса гриппа А(H1N1), Скрежетание зубами (бруксизм), Осторожно: скрытые аллергены
|
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции
При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:
1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в мате-риалах от больного или ВИЧ-инфицированного
Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к поверхностным (gp 120 и gp 41) и внутренним (р 18 и р 24) белкам ВИЧ.
3. Выявление патогномоничнъгх (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.
Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных заболеваний).
1. Вирусологическая диагностика. Материалом для выделения ВИЧ являются Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови.
Полу-ченным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпла-стов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы.
Современные методы ис-следования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.
Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осу-ществляют с помощью моноклональнъгх антител
В последние годы решающее значение для определения прогноза и тя-жести ВИЧ-инфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ТТЦР) — так называемая вирусная нагрузка.
Если у пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в I мл плазмы), это свидетельствует об отсутствии прогрессирования или о медленном прогресси-ровании. Степень заразности при этом минимальная. Высокая вирусная нагруз-ка (более 10000 копий РНК в 1 мл плазмы) у пациентов с числом СО4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о прогрессировании болезни.
Серологическая диагностика. В настоящее время получила наиболь-шее распространение.
Материал для исследовать: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.
С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА).
Это скрининговый метод. Принцип работы основан на клас-сическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироло-вые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифиче-ским антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем.
Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антиге-ном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой.
Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода).
В результате окраска среды меняется пропорционально ко-личеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре.
Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.
Иммунный блотипг является подтверждающим тестом, так как позволяет выявить антитела к различным белкам ВИЧ.
Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электро-форезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыво-ротка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования — выявление ан-тител к различным белкам ВИЧ.
Для этого в систему добавляют антитела про-тив белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой.
Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифиче-ские антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ.
3. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:
1) уменьшения соотношения CD4/CD8 клеток (в N 2 и >, при СПИДе — 0,5 и <);
2) снижения содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);
3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопе-нию, тромбошггопению, лимфопению;
4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;
5) снижения реакции бластгрансформации лимфоцитов на митогены;
6) отсутствие кожной реакции ГТЗ на несколько антигенов;
7) повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.
Предыдущая1234567891011Следующая
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Антитела к ВИЧ 1/2 – составляющие плазмы крови, белковой природы, которые препятствуют размножению ВИЧ-инфекции и полностью нейтрализуют их негативное влияние.
Что такое анализ на антитела к ВИЧ 1/2 (скрининг)
Скрининговый анализ на антитела к ВИЧ 1,2 – система тестов, которые позволяют выявить лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита. Помимо этих, существуют и так называемые подтверждающие (вспомогательные)тесты, задача которых заключается в том, чтобы выявить лиц не инфицированных вирусом, но с положительной реакцией на вирус при скрининге.
Суть скринингового исследования ВИЧ-инфекции заключается в определении антител к вирусу иммунодефицита.
Его отличительная особенность в повышенной чувствительности – более, чем 99,5%. Специфика тестирования состоит в том, что скрининг может дать ложноположительный результат, если в организме пациента содержатся аутоантитела.
Идентичный результат может быть выявлен и в случае болезни печени у пациента, противогриппозной вакцинации или же наличия какого-либо острого вирусного заболевания. Исходя из этого, для получения точных результатов, наряду со скринингом, обычно принято делать и упомянутый выше, подтверждающий тест.
Показания для анализа
В медицинской практике существует достаточно обширный спектр показаний для прохождения скринингового обследования.
Пациент может обратиться в лабораторию в случае:
- возникновения подозрения на инфицирование (если имелся близкий контакт с носителем ВИЧ-инфекции);
- при потерях веса, лихорадке;
- пневмонии, которая не поддается обычной терапии;
- заболеваниях хронического характера, возникших по непонятным причинам;
- в процессе подготовки к хирургической операции;
- переливания крови;
- планировании беременности и семьи;
- При воспаленных лимфоузлах;
- Случайных половых связях.
Лица, попадающие в особую группу риска: наркоманы и люди, ведущие беспорядочную половую жизнь.
Как проводится скрининг на на антитела к ВИЧ 1/2
Проведение процедуры подразумевает соблюдение ряда необходимых правил:
- пациент должен сдавать кровь исключительно натощак (пить воду разрешено);
- с момента последнего приема пищи должно пройти не менее восьми часов;
- врач должен быть уведомлен о том, какие лекарства принимает пациент и знать дозировку (если нет возможности даже кратковременной их отмены);
- если пациент в состоянии повременить с применением лекарственных средств, ему рекомендовано это сделать за 10-15 дней до дня манипуляции;
- за день до начала тестирования пациенту желательно отказаться от приема жареных или жирных продуктов, также ему запрещено употреблять алкогольные напитки, курить, ограничить тяжелые физические нагрузки.
Необходимо отметить, что лабораторные исследования на наличие инфекции у детей, которые были рождены от матерей-носителей вируса иммунодефицита, имеют свою специфику.
Поскольку в первые месяцы жизни ребенка, в его крови могут присутствовать материнские антитела к ВИЧ, то по результатам анализа невозможно получить объективную картину о состоянии здоровья новорожденного и даже отрицательный результат отнюдь не означает, что вирус не смог проникнуть через плацентарный барьер.
Для получения точных данных тестирования следует проводить в период 36 месяцев после рождения ребенка.
Услуги по направлению «Современная диагностика»
Клиники по направлению «Современная диагностика»
Перед тестированием или скринингом на антитела к ВИЧ стоят две широкие, но очень четко определенные цели - выявление случаев и эпидемиологический надзор. При выявлении случаев прежде всего нужно уточнить статус инфицированности ВИЧ каждого данного индивидуума для назначения соответствующего лечения или для наблюдения с принятием надлежащих мер.
Цель эпидемиологического надзора заключается в оценке распространенности ВИЧ, распределения случаев инфекции и ее тенденций в группе или целой популяции.
Чувствительность теста на антитела к ВИЧ есть мера его способности точно выявлять эти антитела в пробе, а специфичность теста - мера его способности точно подтверждать отсутствие антител, если их в пробе нет.
В идеале чувствительность и специфичность теста должны достигать 100%. На практике же ни один биологический тест этому требованию не удовлетворяет и тем не менее применяемые тесты на антитела к ВИЧ принадлежат к числу наиболее чувствительных и специфичных тестов, имеющихся в настоящее время
Лабораторная диагностика СПИДа состоит в проведении вирусологических, серологических, иммунологических исследований материала от больных лиц с подозрением на это заболевание.
При вирусологических исследованиях с целью выделения вируса могут быть использованы первичные культуры мононуклеарных клеток крови.
Выделение и идентификация вируса методически сложны и могут выполняться в специализированных лабораториях. Наиболее эффективным методом диагностики, используемым в настоящее время для повседневных массовых обследований, является обнаружение антител к вирусу иммунодефицита человека. Антитела к ВИЧ могут появляться к концу первого месяца заражения. Поданным ряда авторов, для развитиясероконверсии требуется от 4-7 недель до 6 месяцев и больше. Наличие антител имеет диагностическое значение при СПИДе или указывает на риск его развития.
Антитела - не только серологический маркер СПИДа. Выявляясь в предклинической фазе заболевания, они позволяют осуществить его раннюю диагностику. Особую значимость их наличие приобретает для обнаружения носителей.
Антитела выявляются в течение многих лет, практически на протяжении всей жизни. Исследователи установили параллелизм в выявлении вируса и антител к нему, т. е. наличие антител к вирусу иммунодефицита указывает на высокую вероятность того, что человек является вирусоносителем.
Антитела к антигену ВИЧ, появившись в инкубационном периоде, продолжают интенсивно вырабатываться с развитием болезни, так как антигенное раздражение стимулируется и вирионами, выделяющимися из зараженных лимфоцитов, и субвирионными компонентами, попадающими в кровоток при распаде зараженных клеток, и зараженными лимфоцитами.
В то же время провирус, встроенный в геном зараженных клеток, остается недоступным для специфических антител. Этим и объясняется, казалось бы, парадоксальный факт: чем больше антител к вирусу иммунодефицита человека в сыворотке крови, тем легче выделить сам вирус от больного.
Происходит это потому, что антитела, вырабатывающиеся в ответ на инфекцию вируса, не являются нейтрализующими и вследствие этого не оказывают заметного влияния на вирус, а просто присутствуют в организме вместе с ним. Для обнаружения антител (AT) к вирусу СПИДа разработан ряд тестов, позволяющих осуществить исследования на достаточно высоком уровне специфичности и чувствительности. Это методы твердофазного радиоиммунологического анализа, радиоиммунопреципитации, иммунофлюоресцен-ции, иммуноферментного анализа и иммунного блотинга.
Наиболее широкое применение в практике нашли методы иммуноферментного анализа (ИФА), который отличается высокой чувствительностью, возможностью количественного и визуального учета результатов реакции, что делает метод доступным для лаборатории любого уровня.
В ИФА используются зарубежные и отечественные тест-системы.
Клиническое течение ВИЧ-инфекции и СПИДа
Надо проявлять осторожность в отношении детей, рожденных от инфицированных матерей. При отсутствии клиники ребенок считается инфицированным в том случае, если AT к ВИЧ сохраняются после года. При получении положительного результата в ИФА необходимо трехкратно протестировать сыворотки, давшие однократно положительные результаты, и подтвердить положительный результат в независимой системе - иммунном блотинге
Обнаружение AT в реакции ИФА не дает достаточной информации, так как не говорито состоянии исследуемого, а свидетельствует лишь об инкубации, о болезни или о наличии бессимптомной инфекции.
Иммунный блотинг дает большуюинформацию.таккакналичие AT ко многим антигенам ВИЧ характерно для выраженной болезни, в то время как реакция с 1-2 антигенами более характерна для слабовыраженного инфекционного процесса
Информативным является подсчет количества Т (хелперов) и соотношения Т4 к Те (супрессоров) лимфоцитов, определяемых с помощью моно-кпональных антител.
Важным критерием заболевания может служить резкое увеличение количества иммуноглобулинов, особенно А и V. В общем клиническом анализе крови о заболевании может свидетельствовать лимфопения, лейкопения, эритропения, тромбоцитопения, эозинофилия.
Тесты на ВИЧ, используемые для эпидемиологического надзора, не должны обладать такой же точностью, какая требуется для клинических целей.
Однако при очень низкой пораженности ВИЧ в популяции все положительные пробы необходимо исследовать повторно в дополнительных тестах.
Сбор крови для теста на антитела к ВИЧ или для скрининга может сопровождаться регистрацией фамилий обследуемых (поимененный сбор), либо производиться без регистрации фамилий или индивидуальной идентификационной информации (анонимный сбор) (табл.
Для анонимного скрининга без учета идентификационной информации характерны следующие моменты: используются пробы крови, собранные для других целей; гарантируется анонимность благодаря тому, что идентификационные данные не собираются, либо не учитываются; не требуется получать согласия обследуемых; не требуется контакт с консультационными и социальными службами; наконец, что самое важное, сводятся к минимуму ошибки в статистических оценках, зависящие от уровня участия населения.
Хотя при анонимном исследовании на ВИЧ можно получить более точные данные, этот метод имеет следующие недостатки: он не может устранить потенциальное смещение оценки, обусловленное отбором; данные о связанном с высоким риском поведении и других важных переменных недоступны и не могут быть собраны ретроспективно; невозможно установить контакт с пораженными ВИЧ лицами, чтобы сообщить им об их состоянии; обследование можно проводить только в группах лиц, у которых кровь взята для других целей.
В районах, где распространенность ВИЧ-инфекций считается очень низкой, надзор за нею в рамках системы здравоохранения должен прежде всего быть направлен на отдельных лиц или группы населения, для которых характерно поведение, связанное с наибольшим риском заражения Повсеместно к ним относятся лица, имеющие большое число половых партнеров
Кровь для исследования на ВИЧ в такой группе риска легче всего брать в центрах, специализирующихся на лечении болезней, передаваемых половым путем, или подобных им учреждениях.
Если распространено также внутривенное введение наркотиков, пробы крови следует брать у их потребителей в специальных учреждениях.
Сбор крови один раз в 3 или 6 месяцев в группах наибольшего риска из географических районов, где таких групп больше всего, будет обычно достаточным. Исключение могут составить такие группы риска, как наркоманы, практикующие внутривенное введение препаратов, для которых могут потребоваться более частные обследования.
Сейчас ВОЗ занимается созданием системы классификации (стади-рования) заболевания для клинических исследований, которую можно также использовать в испытаниях методов лечения, что может иметь также прогностическую ценность.
Однако такая система не призвана заменить существующие определения СПИДа, используемые при проведении надзора в системе здравоохранения.
В настоящее время повсеместно разрабатываются системы планового (рутинного) надзора за ВИЧ.
Эти системы необходимо адаптировать к существующей эпидемиологической ситуации; так, методы составления выборок в популяциях с очень низкой распространенностью вируса должны обязательно отличаться от применяемых там, где распространенность умеренная или высокая.
Такой надзор предполагает рутинные обследования четко охарактеризованных и доступных групп населения.
В него прежде всего следует включать те группы, которые подвергаются наибольшему риску заражения, и в каждой из этих групп необходимо отбирать постоянное заранее установленное число лиц для обследования.
В последние годы анонимный скрининг в наблюдаемых группах без учета идентифицикационных данных получает все большую распространенность как точный и экономически эффективный способ эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией в системе здравоохранения.
Методы лабораторной диагностики ВИЧ
В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:
а) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;
б) оценка функций клеточного звена иммунной системы.
Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.
Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:
а) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;
б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;
в) диагностики ВИЧ-инфекции, т.
е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.
Система проведения лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции построена по трехэтапному принципу.
Первый этап - скрининговый, предназначен для выполнения первичных исследований крови на наличие антител к белкам ВИЧ. Второй этап референтный - позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить (подтвердить) первичный положительный результат, полученный на скрининговом этапе. Третий этан - экспертный, предназначен для окончательной проверки наличия и специфичности маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики.
Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями.
В практике применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
ИФА (ELISA)-тecт (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими;
Иммунный блот (Western-blot), весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ — 2;
Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100.
Если смесь сывороток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.
Иммунологические методы
количество Т хелперов,
2. соотношение Т4 иТ8,
3. состояние гиперчувствительности,
4. компенсаторная функция Т клеточной системы.
Проявляется гиперпродукцией иммуноглобулинов, они низко аффинны и материал организма расходуется еще больше.
Недостатки: проявляются поздно, некоторые иммунологические показатели могут быть при других инфекциях.
Клинические методы – м.б. сходны с другими заболеваниями, наиболее типичные проявления регистрируются на поздних стадиях, поэтому клиническая диагностика мало эффективна
Основной метод – серологический – реализуется в 2 этапа:
1 – скрининговое обследование – отбор проб к суммарным антителам ко всем белкам иммунного анализа.
Этот этап дает 95% истинных результатов и 5% ложноположительных.
2 – подтверждающий метод – все пробы исследуют с помощью подтверждающего метода. Эта методика позволяет выявить антитела к вирусному белку.
Положительный результат, когда обнаружены антитела не менее чем к 3 вирусным белкам, если к 1 или к 2 результат сомнительный и требует дополнительного обследования.
При первичной серодиагностике ВИЧ-инфекции проводится определение суммарных антител с помощью скрининговых отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций.
На втором (арбитражном) этапе используют более сложный тест - иммуноблот, позволяющий не только подтвердить или отклонить первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.
Интерпретация результатов анализа на антитела к ВИЧ
Достаточно большое количество различных факторов влияет на результат анализа на антитела к ВИЧ и среди них важное значение имеет время проведения анализа после возможного заражения.
В большинстве случаев антитела к ВИЧ можно обнаружить через 6–12 недель после заражения.
Этот период от попадания вируса в организм до появления определяемого количества антител называется периодом положительной сероконверсии или периодом “окна”. Есть редкие случаи появления антител через 6 месяцев после заражения, а сообщения о выявлении антител только через 1 год не имеют доказательств. В настоящее время диагностическая служба использует новые генерации методов ИФА, которые позволяют выявить антитела к ВИЧ через 3–4 недели после заражения, а определенные комбинации этих методов, так называемые стратегии тестирования, сокращают период “окна” до 2–3 недель, т.е.
дают возможность выявить антитела к ВИЧ как только они начинают вырабатываться в организме.
Отрицательный результат означает, что антитела к ВИЧ в крови обследуемого не обнаружены.
Такое состояние называется серонегативностью и означает, как правило, что человек не заражен.
Отрицательный результат не дает никаких гарантий на будущее. Он констатирует только состояние в момент обследования. Существует незначительный шанс, что обследование проведено в период “окна”. Поэтому, если человек раньше рисковал заразиться ВИЧ и получил отрицательный результат тестирования, необходимо пройти повторное тестирование по крайней мере через 6 месяцев после рискованного события.
Положительный результат означает, что в крови обследуемого найдены антитела к ВИЧ.
Такое состояние называется серопозитивностью – человек заражен ВИЧ. Важно понимать, что положительный результат свидетельствует только о ВИЧ-инфекции, а не о заболевании СПИДом.
Тем не менее, крайне важно срезу по получению положительного результата обратиться ко врачу для получения консультаций и, если нужно, медицинской помощи, что позволит поддержать качество жизни на хорошем уровне длительное время.
Неопределенный результат. В редких случаях результат анализа на антитела к ВИЧ неясен.
Лаборатория не может дать ответ серопозитивен человек или серонегативен. В таких обстоятельствах необходимо проконсультироваться с врачом, и еще раз пройти тестирование.
Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции становится крайне важной мерой, т. к. ранее начало лечения может во многом предопределить дальнейшее развитие заболевания и продлить жизнь больного . В последние годы наблюдается весомый прогресс в области выявления этой страшной болезни: на смену старым тест-системам приходят более совершенные, методы обследования становятся более доступными, и их точность значительно повышается.
В данной статье расскажем о современных методах диагностики ВИЧ-инфекции, знать которые полезно для своевременного лечения данной проблемы и поддержания нормального качества жизни заболевшего.
Методики диагностики ВИЧ
В России для диагностики ВИЧ-инфекции проводится стандартная процедура, включающая в себя два уровня:
- ИФА тест- система (скрининговый анализ);
- иммунный блоттинг (ИБ).
Также для диагностики могут применяться другие методики:
- экспресс-тесты.
ИФА тест-системы
На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа.
Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель.
Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФА-тест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%).
Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером).
Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней:
- отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту;
- ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови;
- ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови;
- положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа.
Почему ИФА-тест может давать ложноположительные результаты?
Ложноположительные результаты ИФА-теста на ВИЧ могут наблюдаться при неправильной обработке крови или у больных с такими состояниями и заболеваниями:
- множественная миелома;
- инфекционные заболевания, спровоцированные вирусом Эпштейна-Барр;
- состояние после ;
- аутоиммунные заболевания;
- на фоне беременности;
- состояние после вакцинации.
При вышеописанных причинах в крови могут присутствовать неспецифические перекрестно реагирующие антитела, выработка которых была спровоцирована не ВИЧ-инфекцией.
В последние годы частота ложноположительных результатов существенно снизилась благодаря применению тест-систем III и IV поколения, которые содержат более чувствительные пептидные и рекомбинантные белки (они синтезируются при помощи генной инженерии in vitro). После начала применения таких ИФА-тестов частота ложноположительных результатов значительно снизилась и составляет около 0,02-0,5%.
Выявление ложноположительного результата не означает, что человек инфицирован ВИЧ. В таких случаях ВОЗ рекомендует провести еще один ИФА-тест (обязательно IV поколения).
Кровь пациента отправляется в референс или арбитражную лабораторию с пометкой «повторить» и исследуется на ИФА тест-системе IV поколения. Если результат нового анализа отрицательный, то первый результат признается ошибочным (ложноположительным) и ИБ не проводится. При положительном или сомнительном результате во время второго теста больному обязательно назначается проведение ИБ через 4-6 недель для подтверждения или опровержения ВИЧ-инфицирования.
Иммунный блоттинг
Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки.
Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция проводится на специальной аппаратуре под воздействием электрического поля). На гель из сыворотки крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий.
ИБ считается положительным если:
- по критериям American CDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
- по критериям American FDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160.
В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование.
При отсутствии линий – ИБ является отрицательным.
При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при:
- онкологических заболеваниях;
- беременности;
- частых трансфузиях крови.
В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ).
Полимеразная цепная реакция
Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям.
Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения.
ПЦР применяется в таких случаях:
- для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей;
- для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ;
- для контроля концентрации ВИЧ в крови;
- для исследования донорской крови.
Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций.
Экспресс-методы
Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестах, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска.
Как и после тестов ИФА, результаты экспресс-тестов должны подтверждаться анализом ИБ. Только после этого может ставиться диагноз о ВИЧ-инфицировании.
Существуют экспресс-наборы для домашнего тестирования. Тест OraSure Technologies1 (США) одобрен FDA, продается без рецепта и может применяться для выявления ВИЧ. После проведения теста, в случае положительного результата, больному рекомендуется пройти обследование в специализированном центре для подтверждения диагноза.
Остальные тесты для домашнего использования еще не были одобрены FDA и их результат может быть очень сомнительным.
Несмотря на то, что экспресс-тесты по своей точности уступают ИФА-тестам IV поколения, они широко применяются для дополнительного тестирования населения.
Сдать анализы на выявление ВИЧ-инфекции можно в любой поликлинике, ЦРБ или в специализированных СПИД-центрах. На территории России они проводятся абсолютно конфиденциально, или анонимно. Каждый пациент может рассчитывать на получение медицинской или психологической консультации до или после проведения анализа. Платить за тесты на ВИЧ придется только в коммерческих лечебных учреждениях, а в государственных поликлиниках и больницах они выполняются бесплатно.
О том, какими путями можно заразиться ВИЧ-инфекцией и какие мифы существуют о возможностях заразиться, читайте в
Статьи по теме
